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背景介绍

蛋白酶在细胞外基质重塑、免疫调节、肿瘤进展和凝血等关键生理过程中发挥着不可或缺的作用。其表达或活性的异常与多种病理状态密切相关，例如基质金属蛋白酶2（MMP-2）参与胶质瘤侵袭，前列腺特异性抗原（PSA）是前列腺癌的临床生物标志物，而凝血酶则是凝血级联反应中的关键酶。因此，开发能够以高特异性、实时响应和环境兼容性监测多种蛋白酶活性的检测平台，对于疾病筛查、病理分析和治疗监测至关重要。然而，传统的蛋白酶检测方法（如质谱、表面增强拉曼光谱、电化学、化学发光等）往往依赖昂贵的专用设备、试剂和复杂的样品预处理，限制了其广泛应用。工程化活细胞作为新一代功能性生物材料，凭借其自我复制、环境适应性、自主信号处理和生物放大等内在优势，为构建智能生物界面和实时生物传感提供了新的思路。

研究思路

针对上述挑战，东北师范大学化学学院的Fang Xiaona教授团队，开发了一种基于优化大肠杆菌表面展示系统的可编程活性材料平台。该平台集成了四个协同优化的功能模块：代谢平衡的启动子（J23110）、高效的膜锚定支架（Lpp-OmpA融合系统）、蛋白酶特异性可切割肽底物（PCPs）以及高亮度荧光报告蛋白（sfGFP）。通过模块化的“即插即用”设计，只需简单更换PCPs序列，即可实现对MMP-2、凝血酶和PSA等多种蛋白酶的超灵敏检测。利用流式细胞术进行单细胞分析，该平台对MMP-2、凝血酶和PSA的检测限分别达到26.4、2.16和3.8 fg/mL，比商业化ELISA试剂盒灵敏三到四个数量级。研究还展示了该平台在复杂生物样本（稀释人血清、七种细胞系的上清液和裂解液）中的稳健表现，以及用于抑制剂筛选的能力。通过物理（UV）或化学（高浓度壮观霉素）灭活结合冻干处理，可将活细菌转化为安全的、即用型非活性功能材料，同时保留传感功能。相关内容以An Engineered E. Coli-Based Living Material Platform for Protease Biosensing为题，发表在Advanced Functional Materials！

图片解析

图1. 基于细菌表面展示技术的蛋白酶传感平台示意图： (A) 构建体包含Lpp-OmpA锚定模块、蛋白酶特异性可切割肽底物（PCPs）和荧光报告蛋白sfGFP。(B) 蛋白酶诱导的响应：融合蛋白的特异性切割导致表面荧光发生可测量的变化，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测。(C) 单细胞水平蛋白酶活性测定流程。

图2. 工程化表面展示生物传感器的蛋白酶检测： (A) 遗传电路设计示意图，包含四个模块：启动子、锚定蛋白、蛋白酶切割位点和信号蛋白。(B-E) 电路模块优化：(B) 不同启动子下的MFI和信号降低率；(C) 锚定蛋白类型：Lpp-OmpA系统(pZC38)和AIDA-A系统(pZC49)；(D) 信号蛋白表达水平；(E) 蛋白酶可切割模块不同空间构型下的MFI和信号降低率。(F) 蛋白酶依赖性激活：携带生物传感器质粒pZC52或pZC47的菌株在有无蛋白酶处理下的荧光。(G) 蛋白酶响应的单细胞分析：对照和pZC52工程菌株在蛋白酶切割前后的MFI（n=3000）。(H) pZC52菌株细胞组分的Western blot分析。(I) 激光共聚焦显微镜图像：对照和pZC52菌株在蛋白酶切割前后的明场和sfGFP荧光。(J) 免疫荧光图像：对照和pZC52菌株在蛋白酶切割前后的sfGFP荧光和Cy5荧光。

图3. 实验参数优化： (A) 接种后培养密度的优化。(B) 接种与未接种过夜培养物在有无100 ng/mL MMP-2下的信号比较。(C) 过夜培养物稀释倍数的优化。(D) 不同酶浓度下反应时间的优化。(E) 不同酶浓度下反应温度的优化。(F) 酶反应加热方式的评估。

图4. 全细胞生物传感器用于MMP-2检测的性能： (A) 流式细胞术分析生物传感器对0.1-100,000 pg/mL范围内MMP-2的响应。(B) MFI与MMP-2浓度对数的线性相关性。(C) 生物传感器对潜在干扰物（均为100 ng/mL）的选择性。(D) 递增浓度的抑制剂BB-2516对10 ng/mL MMP-2响应的抑制。(E) 全细胞生物传感器的批内重现性。(F) 菌株活化后-4°C储存的稳定性。

图5. 复杂生物基质中MMP-2的检测： (A) 全细胞生物传感器与ELISA的对比。(B) 回收率分析。(C) 全细胞生物传感器对细胞上清液的响应：3D柱状图显示七种不同上清液类型（MCF-10A、HDF、MCF-7、HepG2、HeLa、A549、T98G）在七种细胞密度下的MFI。(D) 上清液中MMP-2浓度分布热图。(E) ELISA定量上清液中的目标分析物。(F) 全细胞生物传感器对细胞裂解液的响应。(G) 裂解液中MMP-2浓度分布热图。(H) ELISA定量裂解液中的目标分析物。

图6. 模块化生物传感器重编程用于凝血酶和PSA检测： (A) 凝血酶传感机制示意图。(B) 流式细胞术分析显示MFI与凝血酶浓度对数的线性关系。(C) 凝血酶传感器对其他蛋白酶的特异性评估。(D) PSA检测的生物传感器设计示意图。(E) 荧光信号与PSA浓度对数的校准曲线。(F) PSA传感器对各种干扰蛋白酶的特异性评估。

图7. 灭活生物传感器的验证与性能评估： (A) 大肠杆菌灭活和冻干过程示意图。(B) 冻干后测量流程。(C) 不同处理下冻干大肠杆菌的验证：非灭活、壮观霉素灭活、UV灭活。(D) 冻干大肠杆菌菌落荧光强度的统计分析（n=1637）。(E) 冻干大肠杆菌对不同浓度MMP-2的荧光响应。

结论

本研究成功开发了一种基于大肠杆菌表面展示技术的模块化、可编程活性材料平台，用于蛋白酶的超灵敏和选择性检测。通过代谢平衡启动子、空间优化的底物展示和动态报告信号等四个功能模块的协同优化，该平台在单细胞水平实现了对MMP-2（26.4 fg/mL）、凝血酶（2.16 fg/mL）和PSA（3.8 fg/mL）的飞克级检测灵敏度，比商业化ELISA试剂盒高出三个数量级以上。该平台具有模块化重配置能力，通过简单替换切割肽即可适配不同蛋白酶；在稀释人血清和多种细胞系（正常及癌细胞）中表现出优异的复杂基质兼容性和准确性；成功应用于MMP-2抑制剂BB-2516和凝血酶抑制剂阿加曲班的IC50测定，展示了高通量药物筛选潜力；工程化菌株在4°C下储存30天或-80°C下长期储存后仍保持活性；通过化学或物理灭活结合冻干处理，可将活细菌转化为安全的、即用型非活性功能材料，同时保留传感功能。该活性材料平台为低丰度蛋白酶生物标志物的检测提供了强大工具，在肿瘤微环境图谱绘制、炎症监测等领域具有重要的临床转化潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202532125

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